Die Optimierung von ELISA-Experimenten zur Reduzierung von Hintergrundgeräuschen ist der Schlüssel zur Sicherstellung der Genauigkeit der Daten. Die folgenden kombinierten experimentellen Erfahrungen bieten Optimierungsempfehlungen für Schließen, Waschen und Antikörper-Auswahl:

Optimierung geschlossener Bedingungen

Schließen ist ein zentraler Schritt zur Reduzierung unspezifischer Bindungen, wobei folgende Punkte beachtet werden sollten:

Option des Verschlussmittels: 5% Rinderserumabulin (BSA) oder entfettetes Milchpulver wird häufig verwendet, wobei BSA für die meisten Fälle geeignet ist, insbesondere wenn die Probe eine hohe Konzentration von Lipiden oder Blutlose enthält, sollte BSA bevorzugt verwendet werden, um Störungen zu vermeiden. Bei der Detektion von Phosphoryliertem Protein ist die Verwendung von abgefettetem Milchpulver mit Casein zu vermeiden.

Schließzeit und Temperatur: Normalerweise ist es bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis 2 Stunden oder 4 ° C über Nacht geschlossen, um die Gleichmäßigkeit zu verbessern. 37 ° C kann die Reaktion beschleunigen, aber es ist notwendig, eine Verdunstung zu vermeiden.

Verschlossene Flüssigkeitsformerierung: Notwendig, um wiederholtes Gefrieren zu vermeiden, das zu einem Ausfall führt.

Optimierung der Wäscheschritte

Eine ausreichende Wäsche ist der Schlüssel zur Verringerung des Hintergrunds:

Auswahl der Waschflüssigkeit: Es wird empfohlen, einen PBS-Puffer mit 0,05% Twain-20 zu verwenden, um nicht gebundene Substanzen zu entfernen.

Anzahl und Dauer des Waschens: Es wird empfohlen, 3-5 Mal je 2-3 Minuten zu waschen, um sicherzustellen, dass die Reststoffe entfernt werden.

Antikörper- und Reagentioptimierung

Antikörper-Masse: Wählen Sie hochspezifische primäre und sekundäre Antikörper und optimieren Sie die Verdünnungs- und Inkubationszeiten, um Kreuzreaktionen zu vermeiden.

Display-Kontrolle: angemessene Anpassung der Konzentration und Zeit des Display-Reagents, um zu vermeiden, dass übermäßige Display zu einer erhöhten Hintergrundlage führt.

Weitere Hinweise

Proteinbelastung: Stellen Sie sicher, dass die beladene Proteinqualität geeignet ist und vermeiden Sie, dass eine Überbelastung zu einer nicht spezifischen Bindung führt.

Experimentale Umgebung: Vermeiden Sie starkes direktes Licht, insbesondere in der Farbdesignation und der Erkennungsphase.