Um die Detektionseffizienz der herkömmlichen PCR zu optimieren, ist neben der Optimierung des Reaktionssystems und des Primärdesigns auch die Feinangestellung des Amplifikationsprozesses erforderlich. Hier sind einige der wichtigsten Strategien:

1. Gradient PCR bestimmt die optimale Ausbrenntemperatur
Die Ausbrenntemperatur ist für die Vergrößerungsspezifizität entscheidend. Die Ausbrenntemperatur kann durch Gradient-PCR (z. B. die Einstellung eines Gradientes von 50 °C bis 65 °C) schnell gescreen werden, um unspezifische Streifen oder Verstärkungsfehler zu vermeiden. Wenn der Primär-Tm-Wert sehr unterschiedlich ist, können Sie "Touchdown-PCR" ausprobieren, d. h. die Ausbrenntemperatur von höheren Temperaturen schrittweise zu senken und das hochspezifische Produkt vorzugsweise zu vergrößern.

2. Optimierung der Zyklusparameter
Prädagogische Zeit: Bei Vorlagen mit hohem GC-Gehalt kann die anfängliche Degeneration auf 5-10 Minuten verlängert werden, um sicherzustellen, dass die DNA entkettet wird.
- Verlängerungszeit: Anpassung an die Länge des Amplifikationssegments (in der Regel 1 kb / min), wobei die Unterschiede in der Enzymaktivität beachtet werden. Zum Beispiel kann ein High-Fidelity-Enzym länger dauern.
- Anzahl der Zyklen: Regelmäßige Vergrößerung empfiehlt 25-35 Zyklen. Zu viele Zyklen erhöhen das Risiko von Primärdimeren, wodurch Empfindlichkeit und Spezifizität durch Verdünnung der Schablone oder Reduzierung der Zyklenzahl ausgewogen werden können.

3. Verwendung von Additiven
DMSO oder Betaine: kann die Auswirkungen komplexer sekundärer Strukturen lindern, insbesondere für lange Fragmente oder Schablonen mit hohem GC (empfohlene Endkonzentration 3-5%).
Optimierung der Mg²-Konzentration: Mg²+ ist ein Kofaktor des Taq-Enzyms, dessen Konzentration (in der Regel 1,5-2,5mM) mit den dNTPs ausgeglichen werden muss. Die optimale Konzentration kann durch Gradientenversuche im Abstand von 0,5 mm bestimmt werden.

4. Vorlage Qualität und Quantität
Vermeiden Sie die Verwendung von Schablonen, die Abbau oder Inhibitoren enthalten. Wenn die Probe UmweltDNA ist, können Vorbehandlungsschritte (z. B. Säulenreinigung) hinzugefügt werden. Die Vorlagenmenge wird empfohlen zwischen 1-100ng, zu viel kann zu einer unspezifischen Verstärkung führen und zu wenig erfordert eine Erhöhung der Zykluszahl.

5. Kontrolleinstellungen
Dazu gehören positive Kontrollen (bekannte Vorlagen), negative Kontrollen (ohne Vorlagen) und interne Kontrollen (z. B. Haushaltsgene), um Reagenzvereinigung oder Systemabweichungen auszuschließen.