Nach Abschluss der Isolation und Kultivierung von menschlichen Esophageal-Krebsgeweben aus Fibrozellen ist eine weitere Identifizierung und funktionelle Analyse der Zellen erforderlich, um sicherzustellen, dass ihre biologischen Eigenschaften den experimentellen Anforderungen entsprechen. Folgende wichtige Schritte:

1. Zellmorphologische Beobachtung

- Regelmäßige Beobachtung der Zellmormologie mit dem umgekehrten Mikroskop. Primogene Fibrozellen sind in der Regel shuttle- oder polygonal, klebende Wände wachsen und das Zytoplasma ist gut ausgedehnt. Wenn eine runde schwimmende Zelle oder eine ungewöhnliche Aggregation auftritt, kann dies auf eine Verschmutzung oder einen schlechten Zellzustand hinweisen und die Kulturbedingungen neu bewertet werden müssen.

2. Immunofluoreszenz-Identifizierung

Immunfluorescenzfärbung durch spezifische Marker wie Vimentin, α-SMA. Fibrocytogene sollten Vimentin hoch ausdrücken, während die α-SMA-positive Rate ihren Aktivierungsgrad widerspiegelt. Beachten Sie, dass Sie homotypische Kontrollen festlegen, um nicht spezifische Kombinationen auszuschließen.

3. Funktionale Verifikationsexperimente

Proliferativfähigkeit-Detektion: Die CCK-8- oder EdU-Methode zur Beurteilung der Zellprogrammationsaktivität und zum Vergleich der Unterschiede zwischen Krebs- und krebsförmigen Fibrozellen.

Kollagen-Sekretionsanalyse: Untersuchung des Kollagen-Sekretionsniveaus Typ I / III durch ELISA oder Western Blot, um seine Fibroserhöhungsfähigkeit zu bestimmen.

Kokultivierungsexperiment: Kokultivierung von Fibrozellen mit einer Esophageal-Krebszelllinie (z. B. KYSE-150) zur Beobachtung ihrer Auswirkungen auf die invasive Migration von Krebszellen (z. B. Transwell-Experiment).

4. Einfrieren und Erholung

- Wählen Sie die logarithmischen Wachstumszellen aus, verteilen Sie sie in ein Gefrierrohr mit einer Gefrierflüssigkeit, die 10% DMSO enthält, und übertragen sie nach einer prozeduralen Abkühlung in flüssigen Stickstoff. Bei der Erholung schmilzt das Wasserbad schnell, entfernt die Gefrierflüssigkeit zentrifugierend, suspendiert in einem hochkonzentrierten Serummedium und wechselt die Flüssigkeit nach 24 Stunden.

Hinweise

- strikt steriler Betrieb, um Branchenverschmutzung zu vermeiden;

- Die Anzahl der Übertragung von Primärzellen wird nicht mehr als 5 Generationen empfohlen, um Phänotypdrift zu verhindern;

Die Funktionsexperimente müssen mehr als dreimal wiederholt werden, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.