Das Prinzip der ELISA

ELISA basiert auf der Festung von Antigenen oder Antikörpern und der enzymatischen Markierung von Antigenen oder Antikörpern. Ein Antigen oder Antikörper, der an die Festphasenträgeroberfläche gebunden ist, behält seine immunologische Aktivität, während ein enzymatisch markiertes Antigen oder Antikörper sowohl seine immunologische Aktivität als auch die Aktivität des Enzyms behält. Bei der Messung reagiert die untersuchte Probe (zur Bestimmung des Antikörpers oder des Antigens darin) mit dem Antigen oder dem Antikörper auf der Oberfläche des Festphasenträgers. Der auf dem Festphasenträger gebildete Antigen-Antikörper-Komplex wird durch Waschmethode von anderen Substanzen in der Flüssigkeit getrennt. Hinzufügen von enzymatisch markierten Antigenen oder Antikörpern wird auch durch Reaktion an den Festphasenträger gebunden. Zu diesem Zeitpunkt ist die Enzymmenge in der Festphase in einem gewissen Verhältnis zur Menge der untersuchten Substanz in der Probe. Nachdem das Substrat der Enzymreaktion hinzugefügt wurde, wurde das Substrat durch das Enzym zu einem farbigen Produkt katalysiert, und die Menge des Produkts ist direkt mit der Menge der untersuchten Substanz in der Probe verbunden, so dass eine qualitative oder quantitative Analyse basierend auf der Tiefe der Farbe durchgeführt werden kann. Aufgrund der hohen katalytischen Effizienz des Enzyms wird indirekt das Ergebnis der Immunreaktion verstärkt, so dass die Messmethode eine hohe Empfindlichkeit erreicht.

Typen der ELISA

ELISAs können zur Bestimmung von Antigenen oder auch zur Bestimmung von Antikörpern verwendet werden. Es gibt drei notwendige Reagenzien für diese Bestimmungsmethode: (1) ein festgestelltes Antibakterialgen oder Antikörper, nämlich ein "Immunosorbent"; (2) enzymatisch gekennzeichnete Antigene oder Antikörper, die als "Konjugate" bezeichnet werden; (3) Substrat der Enzymreaktion. Abhängig von der Quelle des Reagents und der Situation der Probe sowie den spezifischen Testbedingungen können verschiedene Arten von Testmethoden entwickelt werden. Es gibt hauptsächlich folgende Arten von ELISAs für klinische Tests:

1. Duale Antikörper Klemmenmethode Antigen

Die Dual-Antikörper-Klemmenmethode ist die häufig verwendete Methode zur Erkennung des Antigens zui, die Betriebsschritte sind wie folgt:

1) Verbinden Sie spezifische Antikörper mit Festphasenträgern, um Festphasenantikörper zu bilden. Waschen entfernt nicht gebundene Antikörper und Verunreinigungen.

2) Prüfproben, Wärmereaktion hinzufügen. Das Antigen in der Probe bindet sich an feste Antikörper und bildet einen festen Antigen-Antikörper-Komplex. Entfernen Sie alle anderen nicht gebundenen Stoffe.

3) Addition von enzymatischen Antikörpern, thermische Isolationsreaktion. Antigene auf dem festen Immunkomplex binden sich an enzym-markierte Antikörper. * Waschen von nicht gebundenen enzym-markierten Antikörpern. Die Enzymmenge, die auf dem Festphasenträger zu diesem Zeitpunkt getragen wird, ist mit der Menge an untersuchten Antigenen in der Probe verbunden.

4) Farbe der Substrate. Der enzymatisch katalysierte Substrat auf der Festphase wird zu einem farbigen Produkt. Durch Farbvergleich wird die Menge an Antigenen in der Probe ermittelt.

In klinischen Tests gilt diese Methode für die Prüfung von Makromolekularen wie Proteinen wie HBsAg, HBeAg, AFP, hCG usw. Sobald heterosexuelle Antikörper gegen das getestete Antigen erhalten werden, kann diese Methode verwendet werden, um feste Träger zu verpacken und Enzymverbindungen vorzubereiten. Wenn die Quelle des Antikörpers Antiserum ist, werden verpackte und enzymatisch gekennzeichnete Antikörper von Tieren verschiedener Gattungen entnommen. Als Anwendung von monoklonalen Antikörpern, in der Regel wählen Sie zwei Monomab gegen verschiedene entscheidende Cluster auf dem Antigen, die für die Verpackung von festen Trägern und die Herstellung von Enzymverbindungen verwendet werden. Diese Zwei-Punkt-Klemmenmethode hat eine hohe Spezifizität und kann die getestete Probe mit enzymatisch orientierten Antikörpern für einen Schritt-Test thermisch isolieren. Bei einer Schrittmessung, wenn der Anteil an untersuchten Antigenen in der Probe hoch ist, bindet sich die überschüssige Menge an die Festphase-Antikörper bzw. an die enzym-orientierten Antikörper und bildet keinen "Klampenkomplex". Ähnlich wie in der Fällungsreaktion des Antigenüberschüsses, wenn der Absorptionswert der Farbe nach der Reaktion (auf dem Antigenüberschüsse) und die Standardkurve (auf dem Antikörperüberschüsse) der gleiche Absorptionswert einer bestimmten Antigenkonzentration ist, wie gemessen nach der üblichen Methode, wird das Ergebnis niedriger als der tatsächliche Gehalt sein, das Phänomen wird als Hakeneffekt bezeichnet, da die Standardkurve nach dem Erreichen des Spitzens hakenförmig gebogen ist. Wenn der Hakeneffekt schwer ist, kann die Reaktion nicht einmal farbig sein und falsch negative Ergebnisse auftreten. Daher sollten bei der Bestimmung von Substanzen, deren Gehalt in einer Probe ungewöhnlich erhöht werden kann (z. B. HBsAg, AFP und hCG im Urin usw.) mit einem Schrittreagens hohe Zui-Werte im messbaren Bereich beachtet werden. Die Herstellung solcher Reagenzien mit hochaffinen monoklonalen Antikörpern kann den Hakeneffekt schwächen. Wenn mehrere identische Determinationskluster an verschiedenen Stellen des untersuchten Moleküls enthalten sind, wie z. B. ein Determinationskluster für HBsAg, können auch die Enzymverbindungen mit dem gleichen Monomab-Paket für diese Determination festgehalten und hergestellt werden. Aber bei der Ermittlung von HBsAg sollten Sie auf Subtypen achten, HBs Ag hat adr, adw, ayr, ayw4 Subtypen, obwohl jeder Subtyp die gleiche a-Determination-Cluster-Reaktivität hat, was auch ein Problem ist, das Sie mit Monomab als Klipsierung beachten sollten. Ein weiterer Punkt der Aufmerksamkeit der Dual-Antikörper-Klipsimetrie Antigen ist die Störung von rheumatoiden Faktoren (RF). RF ist ein Autoantikörper, meist IgM-Typ, der an den Fc-Segment einer Vielzahl von tierischen IgG binden kann. Serumproben, die als Dual-Antikörper-Klipsie-Test verwendet werden, enthalten R F, kann es als Antigen-Komponente wirken, während es sich an Festphasen-Antikörper und enzymatisch-orientierte Antikörper bindet und eine falsch positive Reaktion zeigt. Die Verwendung von F(ab') oder Fab-Segmenten als Reagenzien für Enzymverbindungen eliminiert die RF-Störungen durch die Entfernung des Fc-Segments. Ob ein Dual-Antikörper-Klebstoff-ELISA-Reagenz von RF beeinflusst wird, wurde als ein Bewertungsindikator für diese Art von Reagenzen aufgeführt. Die Dual-Antikörper-Klemmenmethode eignet sich für die Bestimmung von binären oder mehr binären Makromolekularen-Antigenen, eignet sich jedoch nicht für die Bestimmung von Semi-Antigenen und kleinmolekularen monovalenten Antigenen, da sie keine Zwei-Punkte-Klemmenmethoden bilden können.

2. Dual Antigen Clamping Antikörper

Das Reaktionsmuster ist ähnlich wie bei der Dual Antibody Clamping Methode. Verpacken Sie mit spezifischen Antigenen und bereiten Sie Enzymverbindungen, um entsprechende Antikörper zu erkennen. Der Unterschied zu indirekten medizinischen Antikörpern besteht darin, dass sie durch enzymatische Antigen ersetzt werden. Die in dieser Methode untersuchten Proben müssen nicht verdünnt werden und können direkt zur Messung verwendet werden, so dass ihre Empfindlichkeit relativ höher ist als die indirekte Methode. Der Test gegen HBs in Hepatitis B-Markern wird häufig verwendet. Der Schlüssel zu dieser Methode liegt in der Vorbereitung von enzymatisch markierten Antigenen, die entsprechende Markierungsmethode nach der unterschiedlichen Antigenstruktur zu finden.

Indirekte Antikörper

Die indirekte Methode ist die häufig verwendete Methode zur Erkennung von Antikörpern. Das Prinzip besteht darin, enzym-markierte Antikörper (Antiglobulin-Antikörper) zu verwenden, um getestete Antikörper zu erkennen, die an Festphasenantigene binden, daher als indirekte Methode bezeichnet werden (siehe Abbildung 2-3). Die Schritte sind wie folgt:

1) Verbinden Sie spezifische Antigene mit Festphasenträgern, um Festphasenantigene zu bilden. Waschen entfernt nicht gebundene Antigene und Verunreinigungen.

2) Verdünntes getestetes Serum hinzufügen, eine thermische Isolationsreaktion. Spezifische Antikörper im Serum binden sich an ein Festphasenantigen und bilden einen Festphasenantigen-Antikörperkomplex. Nach dem Waschen verbleiben nur spezifische Antikörper auf dem Festphasenträger und die anderen Bestandteile im Serum werden während des Waschprozesses entfernt.

3) Antikörper gegen Enzyme. Es kann ein Enzym gegen menschliches Ig verwendet werden, um den gesamten Antikörper zu erkennen, aber in der Regel wird ein Enzym gegen menschliches IgG verwendet, um IgG-Antikörper zu erkennen. Antikörper im festen Immunkomplex binden sich an enzym-markierte Antikörper und markieren somit indirekt das Enzym. Nach dem Waschen korreliert das Enzym auf dem Festphase-Träger positiv mit der Menge der untersuchten Antikörper in der Probe.

4) Substrat-Färbung Diese Methode wird hauptsächlich zur Diagnose von Infektionskrankheiten bei der Detektion von Antikörpern gegen Krankheitserreger verwendet.

Der Vorteil der indirekten Methode besteht darin, dass ein Verfahren zur Detektion entsprechender Antikörper mit demselben enzymatischen Antikörpern erstellt werden kann, solange das Transformationspaket mit Antigen versehen ist. Der Schlüssel zum Erfolg der indirekten Methode liegt in der Reinheit des Antigens. Obwohl es manchmal auch möglich ist, wirksame Ergebnisse mit groben Antigenpackungen zu erzielen, sollten sie so weit wie möglich gereinigt werden, um die Spezifizität des Tests zu verbessern. Besondere Aufmerksamkeit sollte darauf gelegt werden, Verunreinigungen zu entfernen, die mit dem allgemeinen gesunden menschlichen Serum reagieren können, wie z. B. das Rekombinationsantigen mit E. Coli als Engineering-Enzym, das, wenn es E. Coli-Komponenten enthält, wahrscheinlich mit Anti-E. Coli-Antikörpern in den Blutzellen von E. Coli-infizierten Personen reagiert. Das Antigen darf auch keine Substanzen enthalten, die mit dem Enzymstandard reagieren, wie z. B. Antigene aus menschlichem Plasma oder menschlichem Gewebe, z. B. wenn Ig nicht entfernt wird, wird auch eine falsch positive Reaktion im Test aufgetreten. Darüber hinaus, wenn das Antigen keine verwandten Proteine enthält, kann es auch die Paketwirkung beeinflussen, weil es sich um Adsorption kümmert. Ein weiterer Störfaktor in der indirekten Methode ist die Unspezifizität der hohen Konzentrationen, die im normalen Serum enthalten sind. Die spezifischen IgG, die im Serum des Patienten getestet wurden, machen nur einen kleinen Teil des gesamten IgG aus. Die Adsorptionsfähigkeit von IgG ist stark, und nicht-spezifische IgG kann direkt an den Festphasenträger und manchmal auch an die Oberfläche des Antigens, das mit dem Antigen versehen ist, adsorbiert werden. Daher wird in der indirekten Methode das Antigenpaket in der Regel mit einem unabhängigen Protein (z. B. Rinderserumprotein) verpackt, um die leere Lücke auf der Festphase zu blockieren. Darüber hinaus muss die Probe während des Tests zunächst verdünnt werden (1:40 bis 1:200), um eine zu hohe negative Basis zu vermeiden, die das Urteil des Ergebnisses beeinflusst.

4. Wettbewerbsrecht Antikörper

Diese Methode kann verwendet werden, um spezifische Antikörper zu erkennen, wenn Störstoffe im Antigenmaterial nicht leicht entfernt werden oder ausreichend gereinigte Antigene nicht leicht erhalten werden. Das Prinzip besteht darin, dass Antikörper in der Probe und eine bestimmte Menge an enzymatisch orientierten Antikörpern konkurrieren, um sich an feste Phasenantigene zu binden. Je größer die Menge an Antikörpern in der Probe ist, desto weniger Antikörper binden sich an die Festphase, so dass die positive Reaktion hell als die negative. Wenn das Antigen hochrein ist, kann es direkt gehüllt werden. Wenn es Störstoffe im Antigen gibt, kann die direkte Verpackung nicht einfach erfolgreich sein, kann die Erfassungsverpackungsmethode verwendet werden, d. h. zuerst wird der Antikörper mit dem Festphasenantigen verpackt, dann wird das Antigen hinzugefügt, um das Festphasenantigen zu bilden. Das Waschen entfernt die Verunreinigungen aus dem Antigen und fügt anschließend die Probe und den enzym-orientierten Antikörper für eine konkurrierende Bindungsreaktion hinzu. Es gibt eine Vielzahl von Mustern für die Konkurrenz zwischen Proben und enzymatisch orientierten Antikörpern und Festphasenantigenen, die in der Regel durch eine Anti-HBc-ELISA verwendet werden. Ein anderes Modell besteht darin, dass die Probe zusammen mit dem Antigen zu einem Festphase-Antikörper für die Konkurrenz-Bindung hinzugefügt wird, der nach dem Waschen mit einem enzymatischen Antikörper versehen wird und mit dem an die Festphase gebundenen Antigen reagiert. Diese Methode wird in der Regel gegen HBe getestet.

5. Wettbewerbsrecht Antigen

Kleinmolekulares Antigen oder Semi-Antigen fehlen mehr als zwei Stellen, die zur Klemmenmethode verwendet werden können, daher können sie nicht mit der Dual-Antikörper-Klemmenmethode bestimmt werden, und das Wettbewerbsmodell kann verwendet werden. Das Prinzip besteht darin, dass Antigene in der Probe und eine bestimmte Menge an enzymatisch markierten Antigenen konkurrieren, um sich an feste Antikörper zu binden. Je größer der Anteil an Antigenen in der Probe ist, desto weniger an die Festphase gebundenes Enzym-Antigen und desto heller ist die Farbe nach Zui. Kleinmolekulare Hormone, Medikamente und andere ELISA-Tests werden häufig mit dieser Methode verwendet.

6. Erfassung Paket durch Antikörper gesetzlich getestet

Der Nachweis von IgM-Antikörpern wird bei der frühen Diagnose von Infektionskrankheiten verwendet. Indirekte ELISAs sind in der Regel nur für die Detektion von Gesamtantikörpern oder IgG-Antikörpern geeignet. Wenn IgM-Antikörper direkt mit der indirekten Methode der Antigenverpackung bestimmt werden, da in der Regel eine höhere Konzentration von IgG-Antikörpern in der Probe gleichzeitig vorhanden ist, wird letzteres konkurrieren, um sich an die Festphase-Antigen zu binden, so dass ein Teil des IgM-Antikörpers nicht an die Festphase binden kann. Daher, wenn man antihumane IgM als binäres Antikörper verwendet, um indirekt IgM-Antikörper zu bestimmen, muss die Probe zuerst mit A-Protein oder Anti-IgG-Antikörper behandelt werden, um die Interferenz von IgG zu beseitigen. Bei der Bestimmung von Antikörpern IgM in klinischen Tests wird die Capture Pack Methode verwendet. Zunächst wird ein Anti-Human-IgM-Antikörper-Paket gehalten, um IgM in Serumproben (einschließlich spezifischer IgM-Antikörper gegen Antigene und nicht-spezifischer IgM) zu erfassen. Anschließend wird ein Antigen hinzugefügt, das nur an spezifisches IgM bindet. Anschließend werden spezifische Antikörper gegen Antigene enzymatisch markiert. Dann mit dem Substrat, die Farbe ist mit der IgM-Positivität in der Probe korreliert. Diese Methode wird häufig für die frühzeitige Diagnose von viralen Infektionen verwendet. Das Muster der Detektion von Antikörpern gegen das Hepatitis A-Virus (HAV) ist in Abbildungen 2-7 dargestellt. Rheumatoide Faktoren (RF) können auch die Erfassungspakete stören, um IgM-Antikörper zu bestimmen, was zu falsch positiven Reaktionen führt. Daher wurden indirekte Methoden zur IgG-Neutralisierung in jüngster Zeit sehr bevorzugt, und mit diesen Reagenzien wurden Anti-CMV-IgGM- und Anti-Toxoplasmus-IgM-Antikörper erfolgreich nachgewiesen.

ABS-ELISA-Verfahren

ABS steht für Avidin-Biotin-System. Affinität ist ein Zuckerprotein mit einem Molekulargewicht von 60.000, jedes Molekül besteht aus vier Untereinheiten, die sich an Biotin binden können. Biotin ist eine kleine molekulare Verbindung mit einem Molekulargewicht von 244. Derivate, die mit chemischen Methoden hergestellt werden - Hydroxyambramid - können mit einer Vielzahl von Molekülen wie Protein und Zucker Biotin-Markierungsprodukte bilden, und die Markierungsmethode ist ziemlich einfach. Die Bindung von Biotin und Affinität ist sehr spezifisch, ihre Affinität ist viel größer als die Antigen-Antikörper-Reaktion, die nach der Bindung sehr stabil sind. Da ein Affinin an vier Biotin-Moleküle binden kann, können die ABS- und ELISA-Methoden in die Enzym-Marker-Affinin-Biotin-Methode (LAB) und die Brücken-Affinin-Biotin-Methode (ABC) unterteilt werden. Beide ersetzen den Enzym-markierten Antikörper (Antigen) im ursprünglichen ELISA-System durch Biotin-markierte Antikörper (oder Antigene). Im LAB reagiert das Festphasenbiotin zuerst mit nicht markierten Affinitäten, bevor das enzymatisch markierte Biotin hinzugefügt wird, um die Empfindlichkeit weiter zu erhöhen. Früher wurde das Affinin aus dem Eiserum extrahiert, ein alkalisches Glycoprotein, das eine hohe Adsorptionsfähigkeit an Polystyren-Träger hat, das in der ELISA verwendet wird, um den Boden zu erhöhen. Kettenschimmel-Homopine, die aus Kettenschimmeln extrahiert werden, haben keinen Nachteil, und es gibt eine Tendenz, das erste in ELISA-Anwendungen zu ersetzen. Da die ABS-ELISA zwei mehr Reagenzien als die herkömmliche ELISA verwendet, werden zusätzliche Betriebsschritte verwendet, wird die ABS-ELISA in klinischen Tests nicht viel angewendet.