MOC2 Zelllinie

MOC2 Zelllinie

Uppaluri Lab Gewebekulturprotokolle für MOC-ZelllinienAktualisiert 12.12.16

Benötigte Materialien (siehe beigefügtes IMDM-Protokoll für Reagenzien, die zur Herstellung von IMDM MOC-Linienmedien erforderlich sind)

Sigma Aldrich: DMSO: D2650-100ml

Fischerwissenschaftlich:

T150Flasks　:　07-200-64

T75 Flaschen : 10-126-37

Cryovials : 03-374-059

45um Filter: 09-754-21

05% Trypsin: sh30236,01

25% Trypsin: sh30042,01

Indolent Linien – MOC1, 22

Aggressive Linien – MOC2

Auftauen von Zelllinien

1. Fügen Sie vor dem Auftauen 21ml IMDM MOC-Linienmedien zu einem T150 hinzu (oder 10ml zu einem T75, wenn Sie in aT75 auftauen möchten)

2. Entfernen Sie cryovial aus flüssigem Stickstoff, Sprühflasche mit 70% Alkohol, um es zu reinigen.

3. Halten Sie die untere Hälfte des Cryovial in 37Cwaterbath (ohne dass der Deckel Wasser berührt, um Kontamination zu vermeiden), bis es ein kleines Stück Eis übrig schwebt.

4. Sprühen Sie Cryovial wieder mit ETOH und legen Sie in die Haube. Pipettieren Sie 1 ml Medien in die 1 ml Zellen und fügen Sie diese 2 ml in den T150 hinzu, der bereits Medien enthält (um 22 ml insgesamt für einen T150 zu machen).

5. Nehmen Sie einige Medien bereits in T150 Kolben und spülen Sie die cryovialand Platte dies, um sicherzustellen, dass Sie alle verbleibenden Zellen in der cryovial übrig haben.

Gefrierende Zelllinien:

Arbeiten Sie schnell, da DMSO für Zellen giftig ist

Für jeden T150-Kolben mit 70-80% Zellkonfluenz 3-4 Flaschen einfrieren.

1. Erntezellen aus T150 wie unten gesehen

2. Drehen Sie in Pellet in 15ml konischer Röhre (1000 U/min x 5 min)

3. Überschwebendes entfallen

4. Tippen Sie 15ml konisches Rohr toresuspendieren Zellen

5. Fügen Sie 1,5 ml IMDM MOC Linienmedien hinzu, rekonstituieren Sie Zellen in Medien – halten Sie auf Eis

6. Fügen Sie 1,5 ml Gefriermittel tropfenweise langsam hinzu, während die Röhre auf Eis ist

Zur Herstellung von Gefriermedien – 20% DMSO in IMDM MOC-Leitungsmedien. Beispiel: Für 20ml Lager - fügen Sie 16ml IMDM MOC Linienmedien und 4ml DMSO hinzu. Spritzenfilter mit .45um Filter

7. Aliquote 1ml je zu 3 Kryovialen

8. Lagern Sie in -80C für nicht mehr als 2 Wochen.

9. Stellen Sie in flüssigen Stickstoff innerhalb von 1-2 Wochen.

Hinweis: Auf Wunsch kann auf 2 ml IMDM und 2 ml Gefriermittel erhöht werden, um in 4 Flaschen zu lagern. Außerdem ist es eine gute Idee, Zellen zu zählen und auf der Flasche aufzunehmen, bevor Zellen gefriert werden.

MOC2 Zelllinie

Eigenschaften der Zelllinie:

Indolent - MOC1: weniger aggressiv basierend auf in vivo Studien. Wenn Sie 1:12 von 80% confluent T150 passieren, dauert es 2-4 Tage, um 80% confluent zu erreichen. MOC1-Zelllinien dauern länger, um aus dem Kolben zu kommen, wenn sie geerntet werden, im Vergleich zu aggressiveren Zelllinien.

Aggressiv - MOC2: aggressiver basierend auf in vivo Studien. Wenn 1:12 von 80% confluent passiert

T150, dauert 2-4 Tage, um 80% Konfluenz zu erreichen. Aggressive Zelllinien kommen viel leichter aus dem Kolben im Vergleich zu indolenten Linien.

Ernte und Passierung von Zellen aus T150, 80% Konfluenz:

1. Gießen Sie Medien aus T150 in den Abfallkolben

2. Waschen Sie einmal mit 10-20 ml PBS. PBS waschen.

3. Fügen Sie 1,5 ml 0,05% Trypsin hinzu, Spitzenkolben, um sicherzustellen, dass Trypsin die gesamte Oberfläche abdeckt und somit alle Zellen berührt (tun Sie dies schnell, damit Zellen nicht zu lange Trypsin ausgesetzt sind), entfallen Sie Trypsin, dann erneut 1,5 ml 0,25% Trypsin auftragen.

4. Platzieren Sie in 37C Inkubator. Inkubieren Sie für 3-4 Minuten für aggressive Zelllinien und könnte bis zu 10-12 Minuten für indolent dauern, aber überprüfen Sie nach 6-8 Minuten.

5. Tippen Sie die Seite des Kolbens absichtlich mehrmals gegen die Handfläche, um Zellen zu lockern

6. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob Zellen frei in Medien schweben. Wenn die meisten nicht sind, legen Sie es für weitere 3-5 Minuten in einen 37C-Inkubator zurück. Versuchen Sie, die Zellen nicht zu lange in Trypsin sitzen zu lassen, da dies die Zellen töten wird.

7. Sobald alle oder die meisten Zellen schweben, fügen Sie 10 ml IMDM MOC-Linienmedien hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren.

8. Pipettieren Medien und Zellen aus Kolben in eine 15ml konische zu Pellet Zellen. Zentrifugieren bei 1000 U/min x 5 min.

9. Gießen Sie den Überstand aus.

10. Zellen bei 1:12 durchzuführen - resuspendieren Sie Zellen in weiteren 12 ml Medien.

11. Nehmen Sie 1 ml davon und legen Sie in einen neuen T150-Kolben mit einem Gesamtvolumen von 22 ml IMDM MOC-Linienmedien (1:12-Verdünnung)

12. Stellen Sie zurück in 37C Inkubator zu wachsen. Sollte 80% Konfluenz in 2-4 Tagen erreichen.

Injektion in die Flanke von Mäusen (heterotope):

Erforderliche Zellkonzentration:

MOC1, MOC22: (1e6 Zellen in 0,15 ml injizieren) = 6,66e6 Zellen/ml MOC2: (1e5 Zellen in 0,15 ml injizieren) = 6,66e5 Zellen/ml

1. Ernte Zellen mit 0,25% Trypsin wie oben erwähnt.

2. Nach der Neutralisierung von Trypsin mit IMDM MOC-Linienmedien, spinnen Sie die Zelle in Pellet (1000 U/min x 5 min) in 50ml konisch. (Hinweis: verwenden Sie 50ml konisch, um kleine Messnadel Zellen für

Injektion.

3. Waschen Sie Zellen, indem Sie das Zellpellet in 10 ml eiskaltes PBS resuspendieren (so viel Medien wie möglich entfernen, die FCS enthalten), drehen Sie die Zelle erneut in das Pellet ab (1000 U/min x 5 min)

4. Waschen Sie die Zellen erneut, indem Sie das Zellpellet in 3-6 ml eiskaltes PBS resuspendieren (das Volumen wird durch die Größe des Pellets bestimmt, da Sie dieses Volumen verwenden, um Zellen zu zählen)

5. Zählen cellsperml mit Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler, mit Trypanblau zu

Eliminieren Sie tote Zellen. Berechnen Sie unter Verwendung der Gesamtzahl der vorhandenen Zellen (Zellen/ml x Gesamtml PBS) das Volumen, das zur Suspension des Zellpellets erforderlich ist, um eine Konzentration von 6,66e6 (MOC1, MOC22) oder 6,66e5 Zellen/ml (MOC2) zu erreichen.

Beispielsweise ist für MOC1 die Zellzahl: 2,8 e6 Zellen/ml x 5 ml (PBS) = insgesamt 14 e6 Zellen. 14e6 Zellen / 6,66e6 Zelle / ml = 2,1 ml PBS, um Zellpellet in zu suspendieren.

6. Drehen Sie die Zellen wieder in Pellet ab. PBS-Überstand ausgießen (ohne Aspiration mit Pipette). Resuspendieren Sie das Pellet im berechneten Volumen an eiskaltem PBS, das erforderlich ist, um geeignete zu erreichen

Konzentration, unter Berücksichtigung, dass es nach dem Gießen von Überstandsmittel ~ 200ul in den 50ml konischen verbleiben wird.

7. 50 ml konisch in Eis übertragen und 0,15 ml (150 ul) Zellen pro Maus in der subkutanen Flanke injizieren.

8. Injektieren Sie Mäuse nach Standardprotokoll. Wir verwenden 1ml Spritze. Wir ziehen Zellen mit 1,5 Zoll 21 Gauge Nadel und wechseln Nadel auf ½ Zoll 26 Gauge Nadel zu injizieren.

Protokoll für 1L Medien